FARMACOLOGÍA Y TOXICOLOGÍA MOLECULAR. Dic. 2007.

Bibliografía recomendada:

Lesk, A.M. "Introduction to bioinformatics" 2dn Ed., Oxford University Press, 2005.  <http://www.oup.com/uk/orc/bin/9780199277872/>

Claverie, J-M & Notredame, C. "Bioinformatics for Dummies"  2nd. Ed.Wiley Publishing, INC. 2006. <http://www.dummies.com/WileyCDA/DummiesTitle/productCd-0470089857.html>

Mount, D. " Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis". CSHL Press, 2004.  <http://www.bioinformaticsonline.org/>

• http://bioinformatics.ucsd.edu/students/courses.cfm
• http://scpd.stanford.edu/scpd/programs/certs/bioinformatics.htm
• http://www.ebi.ac.uk/2can/tutorials/index.html
• http://www.s-star.org/lectures.html...

Video "The Inner Life of a Cell":

• Descarga el visor: http://www.martijndevisser.com/blog/flv-player
• Descarga el video en su versión corta: http://novacripta.cbm.uam.es/bioweb/var/InnerLifeofaCell/harvard_cell.flv
• Descarga el video en su versión larga: http://novacripta.cbm.uam.es/bioweb/var/InnerLifeofaCell/Harvard_full_version.flv
• O visita su página en: http://www.studiodaily.com/main/searchlist/6850.html
...
Otros videos interesantes: http://multimedia.mcb.harvard.edu/media.html

• Obligatorio: Presentación, antes del 31 de Enero, de un cuaderno de prácticas con el contenido de este curso.
El cuaderno se puede entregar en formato de papel o, preferiblemente, mandarlo por correo electrónico:
pagomez@cbm.uam.es
pagomez2005@yahoo.es
• Voluntario: Trabajo bibliográfico sobre alguno de los siguientes temas:
• Alineamiento múltiple de secuencias.
• Modelado de estructura de proteínas.
• Modelado de interacciones proteína-ligando.

• Día 1. Lunes 10-12-07. 9:30 - 11:30.
 
• Presentación del curso. Introducción: <Intro07.pdf>
 
• Estructura 3D de macromoléculas. Visualización y Bases de Datos.
• Protein Data Bank
• PDB File Format Guide.
• Ejemplo: un archivo PDB. (1fsz.pdb)
• Ejemplo: archivo PDB mínimo. (1fsz_minimo.pdb)
• PDB format, an introduction: [PDF]
• OCA browser
• PDBsum
• PQS (Protein Quaternary Structure)

 
• Práctica: Visualización de estructura de proteínas.

 
• Alineamiento múltiple de proteínas. Extracción de información.
• Alineamiento múltiple de las siguientes secuencias utilizando ClustalW: s1-9seq-fasta.txt
• Resultados: <s1-9seqs-alignment.msf> <s1-9seqs-alignment.rtf>
• Comparar con su alineamiento estructural: S1-RNB-RNR-PNP-ECOLI.PDB

 
• Información adicional:
• alineamiento de secuencias <teoría> <práctica>.
• alineamiento estructural.

....
• Ligandos. Obtención de modelos 3D de moléculas pequeñas.

   Ejercicio: generar la estructura 3D de la molécula Ro 25-0187:

...
• Bases de datos BRENDA
• Servidor CORINA
 
• Día 2. Martes 11-12-07. 9:30 - 11:30.

 
• Presentación: Extracción de información a partir de alineamientos múltiples de secuencia [PDF].

 
• EJERCICIO:

En un valle perdido, un grupo de científicos encuentran una ameba mutante que amenaza con destruir la especie humana. Entre los científicos hay dos biólogos expertos, uno en polimerización de microtúbulos y el otro en integración de señales (MAP-Kinasas). Deciden centrar sus trabajos en las dos proteínas que conocen mejor: tubulina y MAP kinase p38alpha (MK14).
Saben que para inhibir la función de ambas proteínas pueden utilizar dos inhibidores específicos: Taxol (tubulina) y el péptido inhibidor "RKPDLRVVIPPS" (MK14).
Tras secuenciar el genoma de la ameba, encuentran que la secuencia de ambas proteínas es la siguiente:

>TUB_MUTANT
MREIVHIQAG QCGNQIGAKF WEVISDEHGI DPTGSYHGDS DLQLERINVY YNEAAGNKYV
PRAILVDLEP GTMDSVRSGP FGQIFRPDNF VFGQSGAGNN WAKGHYTEGA ELVDSVLDVV
RKESESCDCL QGFQLTHSLG GGTGSGMGTL LISKIREEYP DRIMNTFSVV PSPKVSDTVV
EPYNATLSVH QLVENTDETY CIDNEALYDI CFRTLKLTTP TYGWLNHLVS ATMSGVTTCL
RFPGQLNADL RKLAVNMVPF PRLHFFMPGF APLTSRGSQQ YRALTVPELT QQMFDAKNMM
AACDPRHGRY LTVAAVFRGR MSMKEVDEQM LNVQNKNSSY FVEWIPNNVK TAVCDIPPRG
LKMSATFIGN STAIQELFKR ISEQFTAMFR RKAFLHWYTG EGMDEMEFTE AESNMNDLVS
EYQQYQDATA DEQGEFEEEG EEDEA

>MK14_MUTANT
MSQERPTFYR QELNKTIWEV PERYQNLSPV GSGAYGSVCA AFDTKTGHRV AVKKLSRPFQ
SIIHAKRTYR ELRLLKHMKH ENVIGLLDVF TPARSLEEFN DVYLVTHLMG WDLNNIVKCQ
KLTDDHVQFL IYQILRGLKY IHSADIIHRD LKPSNLAVNE DCELKILDFG LARHTDDEMT
GYVATRWYRA PEIMLNWMHY NQTVDIWSVG CIMAELLTGR TLFPGTDHID QLKLILRLVG
TPGAELLKKI SSESARNYIQ SLAQMPKMNF ANVFIGANPL AVDLLEKMLV LDSDKRITAA
QALAHAYFAQ YHDPDDEPVA DPYDQSFESR DLLIDEWKSL TYDEVISFV

Preguntas:
a) ¿Podrán usar taxol para inhibir la polimerización de la tubulina de la ameba? ¿Por qué?
b) ¿Se puede diseñar un compuesto derivado del taxol capaz de inhibirla?

c) ¿Podrán usar el péptido "RKPDLRVVIPPS" para inhibir la actividad de MK14? ¿Por qué?
d) ¿Se puede rediseñar la secuencia del péptido para que recupere su actividad?

Durante la práctica, se irá analizando el caso de la tubulina. El caso de MK14 queda como ejercicio libre para el alumno.
(un archivo interesante para descargar: 1lew.pdb)
 

• Paso 1: Análisis de la secuencia de "TUB_MUTANT"
 
• Búsqueda, en las bases de datos de swissprot y pdb, de homólogos de "tub_mutant".

[BLAST_EMBL] [BLAST_EBI] (Resultados: <Blast2pdb.html> <Blast2swiss.html>)
 
• Búsqueda, en el servidor OCA-PDB, de la estructura 1TUB. (Resultado: <1tub.pdb> <1tub_B.pdb>)
Analizar la estructura 1TUB. ¿Qué aminoácidos se encuentran en contacto con el taxol?
 
• Análisis de la secuencia "tub_mutant":
- Salvar de forma local la secuencia de 50 proteínas (de swissprot) homólogas a "tub_mutant".
- Generar un alineamiento múltiple de secuencia con todas ellas más "tub_mutant".
- ¿Qué parecidos y semejanzas hay entre ellas?
Algunos archivos: <51_tubulin_fasta.txt> <51_tubulin.msf> <51_tubulin_msf.doc>
 
• Día 3. Miércoles 12-12-07. 9:30 - 11:30.
 
• Paso 2: Modelado por homología de la estructura 3D de "TUB_MUTANT"

 
• Presentación: Predicción de estructura de proteínas: Modelado por homología [PDF].
 
Ejemplo:  Uso de DeepView como herramienta para el modelado por homología: Proteína FTSA de E. Coli.
 

FTSA_ECOLI_seq.txt

Secuencia problema

Blast2_PDB [DEMO]

PDB OCA Browser [DEMO]

1e4f.pdb	3D coordinates of FtsA (Apo Form) from Thermotoga Maritima
P000001_.html	Results: web page
P000001_.pdf	Results: PDF
Model_1_project.pdb	THEORETICAL MODEL (plus template)
Model_1.pdb	THEORETICAL MODEL
SPDBV_help_page.html	Help page

.
 
• Modelado de TUB_MUTANT:

Secuencia problema: <TUB_MUTANT.txt>
Moldes: <1TUB.pdb> <1TUB_B.pdb>
Alineamiento: <51_tubulin.msf> <51_tubulin_msf.doc>

 
• Día 4. Jueves 13-12-07. 9:30 - 11:30.
 
• Modelado de TUB_MUTANT:

Análisis de los resultados del modelado de TUB_MUTANT utilizando Swiss Model:
<Model_TUB_mutant.pdf>
<Model_TUB_mutant.pdb>
<Model_TUB_mutant_plus_template.pdb>


Del archivo <Model_TUB_mutant_plus_template.pdb>, utilizando Rasmol y/o Notepad2 extraer:
1.- El modelo final de TUB_MUTANT: <1TUB_B_D224W.pdb>
2.- Las coordenadas 3D del taxol: <TXL.pdb>
3.- Un archivo conteniendo los dos modelos anteriores: <TUB_MUTANT_TXL.pdb>
 

Estructura del taxol (paclitaxel)

Utilizando Rasmol y Notepad2, ¿Cómo se podrían modificar las coordenadas del archivo TXL.pdb para que encajen en la nueva estructura del TUB_MUTANT? (Una sugerencia: <TXL2.pdb>, <TUB_MUTANT_TXL2.pdb>.
 

• Paso 3: "docking in silico" de ligandos.
 
Documentación adicional:
• Artículo 1: Current Pharmaceutical Desing (2005) -pdf-
• Artículo 2: Nature (2004) -pdf-


  Archivos para descargar y visualizar con pymol:
 

• Ejemplo de utilización de DOCK/CDOCK:

R. pdb: estructura tridimensional del receptor (Proteína FtsZ de Pseudomonas aeruginosa).
L.pdb: estructura tridimensional del ligando (GDP)
Resultados:
todos.pdb: 1000 posiciones alternativas del ligando en el centro activo de la enzima -receptor-.
Algunos de los mejores resultados:
[24.pdb]  [312.pdb]  [456.pdb]  [467.pdb]  [606.pdb] [898.pdb]
• Ejemplo de utilización de AUTODOCK:

CPT1_CTER_DOCK.PDB: Modelo 3D de la proteína Carnitina palmitoyltransferasa.
MLC_SUR.PDB: Modelo de interacción con el ligando natural Malonyl-CoA.
ro25-187_dock.pdb: Algunos modelos de interacción con el fármaco Ro25-0187.
...
•   Día 5. Viernes 14-12-07. 9:30 - 11:30.
 
Docking proteína-ligando utilizando "HEX"

Introducción al programa HEX: [farmamol07_hex.pdf]
Manual del programa Hex: [hex_manual.pdf]

Documentación adicional:

• "Evaluation of Protein Docking Predictions Using Hex 3.1 in CAPRI Rounds 1 and 2", D.W. Ritchie (2003)  PROTEINS: Struct. Funct. Genet. 52, 98-106.
• "Protein Docking Using Spherical Polar Fourier Correlations", D.W. Ritchie & G.J.L. Kemp (2000) PROTEINS: Struct. Funct. Genet. 39, 178-194.


  Práctica 1:

Modelado de la interacción entre la estructura de TUB_MUTANT: [TUB_MUT_RECEPTOR.PDB]
y el ligando "taxol-2": [TXL2_position2.pdb]

1.- Abrir el programa Hex:

File -> Open receptor -> TUB_MUT_RECEPTOR.PDB
File -> Open ligand -> TXL2_position2.pdb
Control -> Docking:
    Search Mode= Orbit Ligand
    Correlation= Shape + Electrostatic
    Radial Filter= Re-entrant
    PostProcessing= None
    Grid Dimension=0.6 (Solutions: 500)
    Receptor Range= 0 (samples=362 -indiferente-)
    Ligand Range=30 (samples=492)
    Twist Range=360 (samples=128)
    Distance Range=40
    Scan Step: 0.75 (SubSteps =2)
    Steric Scan=ON (n=16)
    Final Search=25
Activate.

2.- Comparar los diferentes modelos obtenidos.

Salvar el fichero de resumen:
File -> Save -> Summary [dock_TXL2_summary.txt]
Salvar los modelos más interesantes:
File -> Save -> Both. Los 7 resultados:

[dock_TXL2_SOL_1.pdb]
[dock_TXL2_SOL_2.pdb]
[dock_TXL2_SOL_3.pdb]
[dock_TXL2_SOL_4.pdb]
[dock_TXL2_SOL_5.pdb]
[dock_TXL2_SOL_6.pdb]
[dock_TXL2_SOL_7.pdb]

 Save -> Complex. (Todos los resultados de docking):[dock_TXL2_SOL_ALL7_range.pdb]

3.- Los resultados pueden visualizarse con Pymol (Actions -> preset -> ligand sites -> solid):

 Práctica 2:

Modelado de la interacción entre la estructura de TUB_MUTANT:  [TUB_MUT_RECEPTOR.PDB]
y el taxol original: [TXL_position2.pdb]

Ficheros de resultados:
El fichero de resumen:
File -> Save -> Summary [dock_TAXOL_summary.txt]
Los 8 resultados:
File -> Save -> Both.

[dock_TAXOL_SOL_1.pdb]
[dock_TAXOL_SOL_2.pdb]
[dock_TAXOL_SOL_3.pdb]
[dock_TAXOL_SOL_4.pdb]
[dock_TAXOL_SOL_5.pdb]
[dock_TAXOL_SOL_6.pdb]
[dock_TAXOL_SOL_7.pdb]
[dock_TAXOL_SOL_8.pdb]

File -> Save -> Complex. (Todos los resultados de docking): [dock_TAXOL_SOL_ALL8_range.pdb]

PREGUNTA: A la luz de los resultados de docking. ¿Hubiese sido necesaria la modificación química del taxol (si/no)? ¿Por qué?
 

 

Paulino Gómez-Puertas. Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa". C/ Francisco Tomas y Valiente, 7. Campus UAM. Cantoblanco, 28049 Madrid. Spain Tel: (+34) 91-497-2377   Fax: (+34) 91-497-4799

BIOWEB - CBMSO Dic. 2007